CCK8細(xì)胞增殖毒性檢測試劑盒的使用要求主要包括以下幾個方面:
1.細(xì)胞接種
細(xì)胞數(shù)量:通常細(xì)胞增殖實驗每孔加入約2000個細(xì)胞,細(xì)胞毒性實驗每孔加入5000~10000個細(xì)胞。具體數(shù)量需根據(jù)細(xì)胞的大小、細(xì)胞增殖速度等決定。
培養(yǎng)時間:一般建議貼壁生長24小時,讓細(xì)胞充分貼壁且生長狀態(tài)穩(wěn)定,便于后續(xù)實驗操作與結(jié)果分析。
接種混勻:接種時注意細(xì)胞懸液一定要混勻,避免細(xì)胞沉淀導(dǎo)致每孔中的細(xì)胞數(shù)量不等??梢悦拷臃N數(shù)孔即混勻一下,確保細(xì)胞分布均勻。
2.藥物處理
設(shè)置對照:需設(shè)置空白組和對照組,空白組不加細(xì)胞只加培養(yǎng)基,用于扣除本底OD值;對照組加入細(xì)胞和培養(yǎng)基但不添加藥物,用于對比藥物處理組的細(xì)胞存活情況。
藥物濃度與體積:根據(jù)實驗?zāi)康暮图?xì)胞特性,配制不同濃度的藥物溶液,并按一定體積加入到相應(yīng)的細(xì)胞孔中,如每孔加入10μL不同濃度的藥物刺激液。
3.孵育條件
溫度:一般哺乳動物細(xì)胞建議在37°C下進(jìn)行孵育,其他種屬的細(xì)胞可根據(jù)其特定的細(xì)胞培養(yǎng)條件選擇合適的溫度。
氣體環(huán)境:需在含5% CO?空氣及濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育,以維持細(xì)胞的正常生長環(huán)境。
孵育時間:根據(jù)不同實驗細(xì)胞需求選擇適當(dāng)?shù)姆跤龡l件和時間。例如,加藥后的孵育時間可設(shè)置時間梯度,通過觀察數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性(RSD)、OD值的范圍(一般在1.0左右)等來選擇孵育時間。
4.CCK8試劑添加
添加時機:在藥物孵育結(jié)束后,向每孔中加入適量的CCK-8溶液,一般為10μL。注意不要在一開始就加入CCK-8,否則會影響藥物的作用效果和檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
試劑用量:按照說明書的體系加入合適的CCK-8含量。如果細(xì)胞體系較大,可適當(dāng)增加CCK-8的量,但要注意避免試劑過量或不足影響檢測結(jié)果。
5.CCK8細(xì)胞增殖毒性檢測試劑盒吸光度測定
測定波長:使用酶標(biāo)儀在450nm處測定吸光度,此波長是CCK-8試劑檢測的適宜波長。
測定時間:在加入CCK-8試劑后,需再次孵育一段時間再進(jìn)行吸光度測定。對于不同的細(xì)胞類型,孵育時間有所不同,如白細(xì)胞較難顯色,可能需要較長的CCK-8反應(yīng)時間或增加細(xì)胞數(shù)量;懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞相比也較難顯色,孵育時間一般為1-4小時,多數(shù)細(xì)胞在培養(yǎng)30分鐘左右即可肉眼觀察到明顯的顯色反應(yīng),培養(yǎng)3.5-4小時左右檢測效果佳。
6.結(jié)果計算與分析
細(xì)胞存活率計算:細(xì)胞存活率=(實驗孔OD值-空白孔OD值)/(對照孔OD值-空白孔OD值)×100%,通過該公式計算出各組細(xì)胞的存活率,從而評估藥物對細(xì)胞的增殖或毒性影響。
數(shù)據(jù)分析:盡量多設(shè)置復(fù)孔,取平均值以減少誤差。同時,可通過繪制細(xì)胞存活率曲線等方式直觀地展示藥物濃度與細(xì)胞存活率之間的關(guān)系。
